Duże skoki czy małe kroczki? O ewolucji biokatalizatorówCzas czytania: 11 min

Gabriela Janusz

2020-12-08
Duże skoki czy małe kroczki? O ewolucji biokatalizatorów<span class="wtr-time-wrap after-title">Czas czytania: <span class="wtr-time-number">11</span> min </span>

Enzymy to w większości wytwarzane przez komórki białka oraz ich kompleksy z innymi cząstkami, które przyspieszają katalizowane przez siebie reakcje chemiczne. Obecność tych biokatalizatorów warunkuje zachodzenie niemalże wszystkich procesów biochemicznych niezbędnych dla funkcjonowania organizmów. Cząsteczki te zgrupowane zostały w rodziny, bazując na podobieństwie sekwencji aminokwasowej, struktury i mechanizmu działania. Enzymem macierzystym takiej rodziny jest katalizator, który w wyniku przemian dał początek słabej, ale korzystnej cząstce katalizującej nieznaną dotąd reakcję. W konsekwencji musiało dojść do wielu następczych procesów mutacji i selekcji, niezbędnych do utrwalenia i wzmocnienia korzystnych zmian. Szacuje się, że około 1030 generacji musiałoby upłynąć, zanim korzystne przemiany mogłyby ulec ugruntowaniu. W artykule wydanym przez Uniwersytet Zielonogórski czytamy:

Prawdopodobieństwo pojawienia się w najprostszym organizmie wszystkich niezbędnych do jego funkcjonowania enzymów (jest ich około 2000) wynosi 10–40 000 (zajście zdarzenia, którego prawdopodobieństwo wynosi mniej niż 10–50, jest niemożliwe); dla zaistnienia niektórych złożonych struktur (np. hemoglobiny) brakuje czasu ewolucyjnego, jeśli przyjmie się znane nam tempo mutacji; obliczenia te pokazały też, że korzystne mutacje nie występują na tyle często, by za ich pomocą można było wyjaśnić istnienie setek tysięcy zasadniczo odmiennych genów1.

Przekraczałoby to możliwości, jakie daje czas istnienia życia na Ziemi, wskazując tym samym na ograniczenia założeń neodarwinizmu, gdzie kluczową rolę odgrywają przypadkowe mutacje2.

W jednym z wielu badań zgłębiających te zagadnienia uwagę skupiono na przedstawicielach rodziny transferaz PLP-zależnych. Celem było znalezienie dwóch białek w tej wielkiej grupie enzymów, przeprowadzających odmienne reakcje, a jednocześnie wykazujących wysokie strukturalne podobieństwo3. Innowacje funkcji enzymów można podzielić na dwie klasy: pierwszą stanowią ulepszenia na dużą skalę – znajdują się tu enzymy, których nowa funkcja wynika z nowej struktury (nowego fałdu w białku). Drugą klasę tworzą innowacje na małą skalę – zawierają wszystkie przypadki, gdzie nowa funkcja jest wynikiem stosunkowo niewielkiej strukturalnej modyfikacji istniejącego już białka.

Wysoka strukturalna zgodność między dwoma białkami jest silnym świadectwem przemawiającym na rzecz ich homologii – ewolucyjnego pokrewieństwa. Jeśli geny kodujące białka zostały rozdzielone w trakcie specjacji (powstawania gatunków w drodze różnicowania zmian w obrębie populacji), to te struktury (i ich geny) nazywamy ortologami. Jeśli geny zostały rozdzielone w procesie duplikacji – produkty ich transkrypcji nazywamy paralogami. Ortologi zazwyczaj pełnią te same funkcje, podczas gdy paralogi zyskują nowe znaczenie. Nadmiarowość tych samych genów zwykle prowadzi do ich usuwania, ale przypadkowe mutacje mogą przyczynić się do ich adaptacji, a tym samym do wprowadzania innowacji na małą skalę. Może się jednak zdarzyć tak, że już przed procesem duplikacji dojdzie do uzyskania przez enzym nowej funkcji – staje się on wtedy enzymem bifunkcjonalnym4.

Tak czy inaczej, wymagania strukturalne o fundamentalnym znaczeniu dla innowacji na małą skalę nie są ściśle określone. Wiadomo, że przypadkowe spotkania gatunków zapowiadają zaistnienie potrzeby enzymatycznych wyzwań. Ta potrzeba ma racjonalną szansę zajścia – dzięki skorzystaniu z istniejących funkcji, ich wymieszaniu lub wypracowaniu zupełnie nowych ról. Wniosek z tego, że nowe korzystne funkcje, które początkowo mogą być nieznaczną zmianą, z łatwością ewoluują, by stać się wysokoefektywnymi.

Z myślą o ujarzmieniu siły mutacji i selekcji powzięto wiele projektów i badań naukowych. Jednakże wyniki eksperymentów w dość szybkim czasie ostudziły zapał naukowców. W 2010 roku na łamach czasopisma „BIO-Complexity” został opublikowany artykuł, którego autorzy wskazują na złożoność problemu:

Reakcje wymiany, katalizowane przez fizycznie różnorodnych przedstawicieli nadrodzin, można sobie wyobrazić jako „proste” ćwiczenie (re)modelingu: jeśli natura mogła, to dlaczego nie my? Anegdotycznie, podejmowano wiele prób wymiany aktywności między fizycznie różnorodnymi przedstawicielami nadrodzin, ale tylko niektóre z nich udało się zakończyć sukcesem5.

Problemy konwersji funkcji związane są nie tylko z osiąganą efektywnością katalityczną, ale również z wymaganą liczbą mutacji do jej osiągnięcia. Na przykład aminotransferaza asparaginianowa uległa konwersji dzięki zmianie siódmej zasady w dekarboksylazę asparaginianową, która jest około 100 000 razy mniej efektywna (porównując kcat/Km) niż pierwotny enzym. W innych badaniach zmiana w jedenastej parze zasady w dehalogenazie spowodowała jej konwersję do krotonazy, z jedynie 0,005-proc. aktywnością enzymu wyjściowego6. W przypadku konwersji dehydrogenaz hydroksysteroidowych (HSDs) udało się osiągnąć 0,25-proc. aktywność enzymu pierwotnego. Cytując autorów badania:

Nawet jeśli wszystkie przewidywane mutacje konieczne do przemiany 3α-HSD w 20α-HSD zostały wprowadzone, uzyskany mutant […] nie posiada aktywności 20α-HSD7.

Dość często napotykaną trudnością w badaniach nad funkcjonalną konwersją jest nadmierna liczba par zasad, które muszą ulec zmianie. W kilku przypadkach udało się uzyskać tak zwaną nową chemię, ograniczając się do dwóch par zasad. Przykładem enzymu uznawanego za niedawno wyewoluowaną cząsteczkę o zupełnie nowej funkcji jest chlorohydrolaza atrazyny. Zadaniem tego enzymu jest degradacja atrazyny – związku niewystępującego w naturze, używanego jako herbicyd. Za krewniaczy enzym uważa się deaminazę melaminy, która działa podobnie, jednakże zdecydowanie wolniej8.

Hipoteza przypadkowości zdaje się oferować rozwiązanie dla powyższych rozważań, jeśli przyjąć założenie, że innowacje na małą skalę mogą wytworzyć drugą z kolei funkcję, bardziej korzystną niż pierwsza. Pierwotna funkcja gwarantuje zatrzymanie i ekspresję genów, które stałyby się potencjalną matrycą. Oczywistą trudnością zdaje się być minimalne znaczenie pierwotnej funkcji jako punktu startowego. W „Trends in Genetics” z 2002 roku czytamy:

Niektóre funkcje nie mogą być wynikiem serii małych kroków stawianych na drodze pod górę. Wymagają one raczej dłuższych skoków obejmujących mutacje – neutralne lub szkodliwe – jeśli występują pojedynczo. Przykłady funkcji, które mogłyby wymagać wielokrotnych spontanicznych mutacji, uwzględniają pojawienie się nowej katalitycznej aktywności9.

Jak trudne są w rzeczywistości te skoki? W wielkiej nadrodzinie enzymów uznanych za homologi – transferazy fosforanu pirydoksalu – po zidentyfikowaniu par o bardzo dużym podobieństwie struktur, odmiennych funkcyjnie, zastosowano bezpośrednie badania i techniki, by przestudiować istotność różnych łańcuchów bocznych aminokwasów jako determinanty funkcji tych enzymów.

Aby prześledzić strukturalne podobieństwo enzymów, posłużono się badaniem strukturalnych odległości. Do testów wybrano białka o bardzo podobnych parametrach – Kbl i BioF. Oba białka tworzą homodimeryczne enzymy – Kbl2 (ligaza2-amino-3-ketobutyrylo-CoA) i BioF2 (syntaza 8-amino-7-oksononianu) – wykazujące strukturalne i funkcjonalne podobieństwo. Kbl2 jest enzymem zaangażowanym w ścieżkę metabolizmu treoniny, BioF2 zaś jest niezbędnym enzymem w produkcji biotyny – jednego z głównych kofaktorów syntezy kwasów tłuszczowych i innych reakcji karboksylacji. Funkcje tych enzymów u E. coli nie nakładają się, w przeciwieństwie do tych wyizolowanych z T. thermophilus.

Celem doświadczeń było odnalezienie najistotniejszych punktów wymaganych do zmiany funkcji spośród 250 wstępnie wyselekcjonowanych aminokwasów. Badania prowadzono w dwóch kierunkach: po pierwsze – przez porównywanie sekwencji BioF E. coli z sekwencjami BioF z innych bakterii. Pozwoliło to na zidentyfikowanie wszystkich zachowanych par zasad, różniących się od ich odpowiedników Kbl u E. coli. Zgodność sekwencji Kbl powinna przynieść sporo informacji o tym, co jest niezbędne dla występowania funkcji Kbl. Po drugie – przez porównanie struktur enzymów BioF2 i Kbl2 pochodzących z E. coli udało się określić różnice w budowie centrów aktywnych. Łańcuchy boczne formujące miejsce wiążące substrat i powierzchnia katalityczna są najbardziej prawdopodobnymi miejscami specyficzności katalitycznej.

Ostatecznie, dla 15 aminokwasów kandydujących do roli miejsca zajścia konwersji funkcji skonstruowano zmutowany gen BioF, który następnie wraz z plazmidem wprowadzono do zaprojektowanej nici E. coli pozbawionej chromosomalnego genu BioF w celu przetestowania auksotrofii (niezdolności do produkcji) biotyny. Wyniki były zaskakujące, albowiem tylko jedna z dokonanych substytucji wykazała właściwości zakłócające produkcję fenotypu Bio- (zamiana histydyny 152 na asparaginę). Co jeszcze ciekawsze, zmieniony aminokwas znajduje się w pewnej odległości od kieszeni centrum aktywnego. Funkcja histydyny 152, pomimo wnikliwych dalszych testów, nie została zidentyfikowana.

Uznaje się, że centrum aktywne utrzymywane jest przez tak zwane strukturalne „rusztowanie”. Na tej podstawie dwa enzymy o podobnym zwinięciu posiadają również podobną strukturę tego „rusztowania” z istotnymi różnicami w centrach aktywnych. Można by więc oczekiwać, że konwersja funkcji będzie prostą sprawą przeniesienia reszt aminokwasowych z jednego centrum do drugiego. Podjęte w tym kierunku badania tu opisane skończyły się fiaskiem, co powoduje, że oczekiwania zdają się być jeszcze większym wyzwaniem. Autorzy artykułu opublikowanego w „Nature” z 2003 roku przedstawiają sytuację w taki sposób:

Podejmowano wiele prób, by „wymienić” aktywności w fizycznie odmiennych nadrodzinach, ale tylko kilka z nich zakończyło się sukcesem10.

Najbardziej oczywistym wytłumaczeniem dla tych nieoczekiwanych trudności wewnętrznej konwersji funkcji zdaje się być brak znaku równoważności pomiędzy stopniem strukturalnego podobieństwa a strukturalnym „rusztowaniem”. Wiele relatywnie małych strukturalnych różnic może w rzeczywistości mieć istotne znaczenie w pełnieniu funkcji. Jeśli tak jest w istocie, zatem to rusztowanie aminokwasowe „trzyma” miejsce aktywne, ale też stwarza dogodne środowisko – ramy, na podstawie których centra aktywne mogą spełniać swoje zadanie. Tłumaczyłoby to, dlaczego zwykłe przeniesienie reszt aminokwasowych miejsca aktywnego nie przynosi oczekiwanych rezultatów.

Istnieje pewne zastrzeżenie co do różnic między podobieństwem sekwencji a podobieństwem struktury. Wcześniejsze badania wykazały, że możliwe jest utworzenie hybryd dwóch naturalnych izoenzymów posiadających 50% identyczności sekwencji, poprzez zaburzenie i rozerwanie pofałdowań11. Ponieważ pierwotne białka miały niemalże identyczne miejsca aktywne, nadające tę samą funkcję, ich szkielety były swoimi odpowiednikami. Żadna z uzyskanych hybryd nie posiadała jakiejkolwiek funkcji, pomimo że sekwencje hybryd były bardziej zbliżone do sekwencji białek źródłowych aniżeli białka źródłowe względem siebie. To zjawisko można tłumaczyć w ten sposób, że białka „rodzicielskie” różnią się strukturalnie w bardzo spójny sposób – każde z nich ma własny, specyficzny model stabilizacji tego samego fałdowania. Ponieważ niekoherentność strukturalna tych hybryd była dość obszerna, wydaje się, że przyczyną utraty funkcji jest destabilizacja natywnej struktury. W efekcie końcowym wzrost podobieństwa sekwencji powoduje gruntowne obniżenie podobieństwa strukturalnego.

Podsumowując, szeroko rozumiane podobieństwo BioF2 i Kbl2 nie może być jedynie dziełem przypadku. Bazując na typowych technikach pomiarowych podobieństwa struktury – BioF2 i Kbl2 są bliskimi homologami. Nie przekłada się to jednak bezpośrednio na podobieństwo funkcji. Liczba zmian nukleotydów wymaganych do konwersji jest znaczna i tu teoria Darwina napotyka niemały problem. Liczność możliwych kombinacji, wśród których tylko jedna umożliwia uzyskanie minimalnie korzystniejszej funkcji enzymu, jest niewyobrażalna. Pojawia się więc wątpliwość co do losowości i przypadkowości tych ulepszeń. Patrząc na wyniki doświadczeń z wykorzystaniem transferaz PLP-zależnych, powstaje potrzeba kontynuacji tego typu badań, a ich rezultaty mogą dostarczyć argumentów na faktyczną istotność ewolucyjną innowacji na małą skalę.

Gabriela Janusz

 

Źródło zdjęcia: Pixabay

Ostatnia aktualizacja strony: 13.12.2020

Przypisy

  1. G.P. Słowik, K.J. Kilian, Hoyle i matematyczne dylematy ewolucjonizmu, w: Księga jubileuszowa dedykowana Profesorowi Kazimierzowi Jodkowskiemu z okazji 40-lecia pracy naukowej, red. P. Bylica i in., Zielona Góra 2015, s. 395 [395‒408] [dostęp 8 XII 2020].
  2. Por. G.P. Wagner, What Is the Promise of Developmental Evolution? Part II: A Causal Explanation of Evolutionary Innovations May Be Impossible, „Journal Experimental Zoology” 2001, Vol. 291, No. 4, s. 305–309.
  3. Por. A.K., Gauger, D.D. Axe, The Evolutionary Accessibility of New Enzyme Functions: A Case Study from the Biotin Pathway, „BIO-Complexity” 2011, Vol. 1, s. 1‒17 [dostęp 8 XII 2020].
  4. Por. C. Chothia et al., Evolution of the Protein Repetoire, „Nature” 2003, Vol. 300, No. 5626, s. 1701‒1703; A.L. Hughes, Adaptive Evolution After Gene Duplication, „Trends in Genetic” 2002, Vol. 18, No. 9, s. 433‒434; O. Khersonsky, C. Roodveldt, D.S. Tawfik, Enzyme Promiscuity: Evolutionary and Mechanistic Aspects, „Current Opinion in Chemical Biology” 2006, Vol. 10, No. 5, s. 498–508.
  5. Por. Gauger, Axe, The Evolutionary Accessibility of New Enzyme Functions, s. 12.
  6. H. Xiang et al., Interchange of Catalytic Activity Within the 2-Enoyl-Coenzyme A Hydratase/Isomerase Superfamily Based on a Common Active Site Template, „Biochemistry” 1999, Vol. 38, No. 24, s. 7638–7652.
  7. H. Ma, T.M. Penning, Conversion of Mammalian 3α-hydroxysteroid Dehydrogenase to 20α-hydroxysteroid Dehydrogenase Using Loop Chimeras: Changing Specificity From Androgens to Progestins, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America” 1999, Vol. 96, No. 20, s. 11162 [1161–11166].
  8. S. Raillard et al., Novel Enzyme Activities and Functional Plasticity Revealed by Recombining Highly Homologous Enzymes, „Chemistry & Biology” 2001, Vol. 8, No. 9, s. 891–898.
  9. P.A. Romero, F.H. Arnold, Exploring Protein Fitness Landscapes by Directed Evolution, „Nature Reviews Molecular Cell Biology” 2009, Vol. 10, s. 876 [866‒876].
  10. Chothia C. et al., Evolution of the Protein Repertoire, „Science” 2003, Vol. 300, No. 5626, s. 1701 [1701‒1703].
  11. Por. D.D. Axe, Extreme Functional Sensitivity to Conservativeamino-acid Changes on Enzyme Exteriors, „Journal of Molecular Biology” 2000, Vol. 301, No. 3, s. 585‒595.

Literatura:

  1. Axe D.D., Extreme Functional Sensitivity to Conservative amino-acid Changes on Enzyme Exteriors, „Journal of Molecular Biology” 2000, Vol. 301, No. 3, s. 585‒595.
  2. Chothia C. et al., Evolution of the Protein Repertoire, „Science” 2003, Vol. 300, No. 5626, s. 1701‒1703.
  3. Gauger A.K., Axe D.D., The Evolutionary Accessibility of New Enzyme Functions: A Case Study from the Biotin Pathway, „BIO-Complexity” 2011, Vol. 1, s. 1‒17 [dostęp 8 XII 2020].
  4. Gerlt J.A., Babbitt P.C., Enzyme (re)design: Lessons From Natural Evolution and Computation, „Current Opinion in Chemical Biology” 2009, Vol. 13, No. 1, s. 10‒18.
  5. Janion S.M., Ewolucja organizmów i ewolucja współzależności (relacji) między organizmami, „Kosmos” 1995, t. 44, nr 1, s. 229–234 [dostęp 8 XII 2020].
  6. Khersonsky O., Roodveldt, Tawfik D.S., Enzyme Promiscuity: Evolutionary and Mechanistic Aspects, „Current Opinion in Chemical Biology” 2006, Vol. 10, No. 5, s. 498‒508.
  7. Ma H., Penning T.M., Conversion of Mammalian 3α-hydroxysteroid Dehydrogenase to 20α-hydroxysteroid Dehydrogenase Using Loop Chimeras: Changing Specificity From Androgens to Progestins, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America” 1999, Vol. 96, No. 20, s. 11161‒11166.
  8. Raillard S. et al., Novel Enzyme Activities and Functional Plasticity Revealed by Recombining Highly Homologous Enzymes, „Chemistry & Biology” 2001, Vol. 8, No. 9, s. 891‒898.
  9. Romero P.A., Arnold F.H., Exploring Protein Fitness Landscapes by Directed Evolution, „Nature Reviews Molecular Cell Biology” 2009, Vol. 10, s. 866‒876.
  10. Słowik G.P., Kilian K.J., Hoyle i matematyczne dylematy ewolucjonizmu, w: Księga jubileuszowa dedykowana Profesorowi Kazimierzowi Jodkowskiemu z okazji 40-lecia pracy naukowej, red. P. Bylica i in., Zielona Góra 2015, s. 395‒408 [dostęp 8 XII 2020].
  11. Wagner G.P., What is the Promise of Developmental Evolution? Part II: A Causal Explanation of Evolutionary Innovations May be Impossible, „Journal of Experimental Zoology” 2001, Vol. 291, No. 4, s. 305‒309.
  12. Xiang H. et al., Interchange of Catalytic Activity Within the 2-Enoyl-Coenzyme A Hydratase/Isomerase Superfamily Based on a Common Active Site Template, „Biochemistry” 1999, Vol. 38, No. 24, s. 7638‒7652.

6 odpowiedzi na “Duże skoki czy małe kroczki? O ewolucji biokatalizatorówCzas czytania: 11 min

  1. W cytacie “Niektóre funkcje nie mogą być wynikiem serii małych stawianych na drodze pod górę. ” wyraźnie brak jest jakiegoś słowa (serii małych – czego? kroków? mutacji?). Zajrzałem do artykułu wymienionego w przypisie nr 9, znalazłem ten artykuł w internecie, przeczytałem go, ale tej wypowiedzi tam nie ma. Zajrzałem wobec tego do artykułu Gauger i Axe’a. Tam ta wypowiedź jest, ale wygląda na to, że pochodzi z artykułu Philipa Romero i Frances Arnold. Czy rzeczywiście stamtąd pochodzi, nie mogłem sprawdzić, gdyż Uniwersytet Zielonogórski nie ma dostępu do tego artykułu. Ale jedno można było ustalić – brakuje słowa “kroków” albo “kroczków” (steps).

    • Dziękuję za komentarz, brakujące słowo zostało dodane. Faktycznie, przetłumaczony tekst, na który Pan wskazuje, pochodzi z artykułu Romero i Frances Arnold, jak również został on wykorzystany w artykule Gauger i Axe’a.

  2. Bardzo ciekawy tekst. Wygląda na to, że funkcje w żywych organizmach – jak enzymy – są ściśle określone i nie jest łatwo konwertować jeden enzym w drugi, nawet przy inteligentnym działaniu. Przypomina to wytwory naszej zaawansowanej technologii – jeśli chcemu coś tu zmienić nie często wystarczą wyizolowane zmiany, potrzeba solidnego ‘refactoring’.

    Przy okazji – z tą numeracją zasad, czy chodzi tu o zmiany zasad azotowych w DNA?

  3. Widzę, że wskutek mojego komentarza wstawiono brakujące słowo do cytatu oznaczonego przypisem 9. Ale sam przypis jest nadal błędny, na co wcześniej zwróciłem uwagę. Ponieważ redaktor strony i/lub Autorka nie zareagowali, postaram się jaśniej to przedstawić. W artykule Gauger i Axe’a jest następujący fragment:

    The relative difficulty of these innovations has already been acknowledged [26]:

    Some functions, however, simply cannot be reached through a series of small uphill steps and instead require longer jumps that include mutations that would be neutral or even deleterious when made individually. Examples of functions that might require multiple simultaneous mutations include the appearance of a new catalytic activity….

    Jest to dokładnie ten sam cytat, który po przetłumaczeniu na język polski w artykule jest oznaczony przypisem 9. Zacytowany teraz przeze mnie fragment DOWODZI, że cytat pochodzi z pozycji {26] w bibliografii artykułu Gauger i Axe’a. A pozycja {26} w tej bibliografii to nie jest artykuł Hughesa, tylko Romero i Armold.

    Chyba już jaśniej nie potrafię. 🙂

Dodaj komentarz



Najnowsze wpisy

Najczęściej oglądane wpisy

Wybrane tagi