Oporność na antybiotyki jest powszechnie uznawana za przykład „ewolucji zachodzącej na naszych oczach”. W jakiej jednak mierze oporność na antybiotyki rzeczywiście ma związek z przypadkowymi mutacjami? Czy pewne aspekty oporności na antybiotyki są związane z zaprogramowanymi wariantami genów, których proces tworzenia jest uruchamiany przez sam organizm? W niniejszym tekście omówię treść ważnego artykułu, w którym podjęto próbę udzielenia odpowiedzi na te pytania.
W 2019 roku pewien zespół naukowców odkrył białko, które określono mianem Mfd. Usunięcie tego białka utrudnia bakteriom „wyewoluowanie” oporności na antybiotyki1. Białko Mfd to forma translokazy DNA, którą łączono z naprawą wyciętych zasad azotowych nukleotydów, ale badacze ustalili, że w pewnych pozycjach genomu brak tego jednego białka obniża tempo mutacji o dwa do pięciu razy. Skłania to do wniosku, że Mfd kieruje zmianami genetycznymi w tych konkretnych lokalizacjach.
Białko związane z wywoływaniem specyficznych mutacji
Rozważmy więcej szczegółów. W ramach pierwszego eksperymentu badacze wykorzystali opracowany przez Salvadora Lurię i Maxa Delbrücka test fluktuacji, aby obliczyć tempo mutacji u B. subtilis, P. aeruginosa, S. typhimurium i M. tuberculosis w obecności i przy braku Mfd. Zaobserwowano, że szczepy pozbawione Mfd miały o dwa do pięciu razy wolniejsze tempo mutacji pod względem wykształcania oporności na antybiotyk o nazwie „ryfampicyna”. Jest to fascynujące, ponieważ wskazuje, że bakteryjne białko Mfd w istocie powoduje mutacje! Mutacje nie mają związku z jakimś przypadkowym trafieniem promieniowania jonizującego w komórkę. W gruncie rzeczy bakterie same wywołują mutacje.
Są jednak pewne ważne zastrzeżenia:
- Samo to, że tempo mutacji pod względem wykształcania oporności na ryfampicynę rośnie [przy obecności białka Mfd], niekoniecznie wpływa na tempo mutacji całego genomu. Skupienie się na oporności na ryfampicynę oznacza, że podstawą dla obliczonego tempa mutacji jest region liczący 3582 pary zasad2, nie zaś cały genom, na który składa się 4 214 810 par zasad3. W związku z tym w pozostałej części genomu tempo mutacji mogło nie wzrosnąć. (Spoiler: okazuje się, że tak właśnie jest!).
- Nie jest też jasne, czy większe tempo mutacji w genie rpoB jest procesem towarzyszącym, czy uruchamianym w reakcji na wyczucie obecności antybiotyku. Opracowany przez Lurię i Delbrücka test fluktuacji, znany ze swojej roli w rozstrzyganiu między takimi scenariuszami, może pomóc w ocenie tych hipotez, ale w artykule nie napisano wyraźnie, jaki rezultat został zaobserwowany. Osobom, które nie słyszały o tym teście fluktuacji, wyjaśniam, że uznaje się go za potwierdzający hipotezę darwinowską, co oznacza, że mutacje zachodzą losowo, a te korzystne są faworyzowane przez dobór naturalny. Stoi to w opozycji do hipotezy lamarkowskiej, zgodnie z którą mutacje są wynikiem reakcji organizmu na presję selekcyjną.
Autorzy uznali, że związane z brakiem Mfd obniżenie tempa mutacji o dwa do pięciu razy jest umiarkowane, ale podejrzewają, że te różnice mogą wpływać na kinetykę (tempo nabywania oporności) i ewolucję oporności. Sprawdzili więc, jak oporność na antybiotyki (ryfampicynę, fosfomycynę, trimetoprym, kanamycynę i wankomycynę) mogła wyewoluować, mając w punkcie wyjścia niższe stężenia antybiotyków i wykształcając się na przestrzeni 35–70 pokoleń. W ramach tych eksperymentów u S. typhimurium i B. subtilis zaobserwowano 6- do 21-krotną różnicę w tolerancji na stężenie antybiotyków. Dostrzeżono też 32-krotną różnicę w medianie związanej ze stężeniem antybiotyku, które jest tolerowalne przez szczepy mające i niemające Mfd. Białko Mfd umożliwia bakteriom szybsze wykształcenie oporności na wyższe stężenia różnych antybiotyków, które mają w genomie inne cele związane z wykształcaniem oporności.
Inna ważna obserwacja dotyczy tego, że kiedy z upływem czasu zwiększano stężenie antybiotyków (w ramach testu fluktuacji stężenie antybiotyków było natomiast stałe i śmiertelne dla nieprzygotowanych bakterii), dostrzeżono bardziej znaczącą różnicę między szczepami mającymi i niemającymi Mfd. To, że stopniowa akumulacja prowadziła do większej różnicy, wskazywało, że bakterie zapewne wyczuwają toksyny i odpowiednio na nie reagują, na co nie było czasu – zważywszy na jego specyfikę – w ramach testu fluktuacji.
Jak Mfd wywołuje specyficzne mutacje?
Autorzy nie wiedzą, jak dokładnie Mfd wywołuje specyficzne mutacje albo czy robi to bezpośrednio, ale posłużyli się metodą Sangera, aby zsekwencjonować i zidentyfikować warianty genetyczne powstałe w tym przedziale czasu w celach, na które oddziałują ryfampicyna i trimetoprym (odpowiednio – rpoB i folA). Analiza sekwencji w każdym punkcie czasu ujawniła zmiany genetyczne prowadzące do oporności. Przy braku Mfd zaobserwowano tylko około połowę, a nawet jedną trzecią, zmian prowadzących do oporności, a także wolniejsze powstawanie tych zmian. Kluczową rolę Mfd w wywoływaniu specyficznych zmian i wykształcaniu oporności potwierdziło dodatkowo to, że drugą i trzecią zmianę genetyczną rzadko obserwowano w odpowiednich celach przy braku Mfd. Biorąc to wszystko pod uwagę, należy uznać, że Mfd pełni jakąś promutagenną funkcję, która może być niezbędna do wywoływania dodatkowych zmian genetycznych.
Aby sprawdzić, czy mutacje występują również poza tym regionami, autorzy wykonali sekwencjonowanie całego genomu (WGS – whole genome sequencing) w przypadku sześciu losowo dobranych replikatów uzyskanych w trakcie trwania eksperymentu. Wyniki WGS potwierdziły rezultaty uzyskane za pomocą metody Sangera: przy braku Mfd nastąpiło znacznie mniej mutacji w regionie genu rpoB. Co ważne, autorzy nie znaleźli dodatkowych mutacji poza rpoB w żadnym szczepie, który wykształcił oporność na ryfampicynę. Jest to ważne odkrycie, które z dużą siłą wskazuje, że ten mechanizm NIE wywołuje niespecyficznych mutacji w całym genomie, lecz specyficzne mutacje w znanych celach antybiotyków, dzięki czemu wykształca się oporność.
Rezultaty uzyskane za pomocą WGS w przypadku szczepów z wykształconą opornością na trimetoprym były natomiast inne. Badacze odkryli mutacje poza regionem kodującym folA, w regionie jego promotora, jak również powracającą mutację w genie dnaQ prowadzącą do fenotypu hipermutatora:
Odkryliśmy, że trzy z sześciu zsekwencjonowanych dzikich szczepów, które wykształciły oporność na trimetoprym, miały mutację punktową w genie dnaQ (u wszystkich szczepów występowała taka sama mutacja – dnaQ(I33N)), natomiast żaden ze szczepów Δmfd nie miał mutacji w genie dnaQ4.
Spójne z odkryciem mutacji prowadzącej do fenotypu hipermutatora było również odkrycie 600 mutacji nagromadzonych w całym genomie, które według autorów należy zbadać, aby przekonać się, czy odgrywają one funkcjonalną rolę, czy są jedynie mutacjami towarzyszącymi. Obserwacja, że bardzo specyficzna mutacja w dnaQ pojawiła się niezależnie wiele razy, wskazuje, że białko Mfd odgrywa kluczową rolę, wywołując zmiany w specyficznych regionach genomu w reakcji na obecność toksyn (antybiotyków).
Ikona ewolucji
Oporność na antybiotyki to ikona obserwowalnej ewolucji. Niepewne jednak pozostaje, w jakiej mierze za to zjawisko odpowiadają przypadkowe mutacje. Ewolucja darwinowska jest zależna od zdarzeń przypadkowych, takich jak mutacje wywoływane przez promieniowanie jonizujące bądź błędy maszynerii kopiującej DNA. Ważne wyniki omawianego tutaj badania wskazują jednak, że znacząca część oporności na antybiotyki nie jest skutkiem stochastycznych mutacji, lecz rezultatem działania uprzednio zaprogramowanych mechanizmów wywołujących mutacje. To działanie jest ułatwiane przez białko Mfd odgrywające strategiczną rolę w kierowaniu specyficznymi regionami genomu, w których dochodzi do zmian. Ostatecznie prowadzi to do wykształcenia oporności na antybiotyki.
Pokazuje to, że kierowana mutageneza jest istotnie powiązana z opornością na antybiotyki, co podważa powszechnie żywione przekonanie, że oporność na antybiotyki stanowi przykład zachodzenia ewolucji darwinowskiej w czasie rzeczywistym. W tym momencie ciężar dowodu mocniej spada na tych, którzy przyjmują jakąś odwołującą się do przypadku teorię pochodzenia. Jest tak dlatego, że teraz muszą oni wyjaśnić powstanie tego zaprogramowanego mechanizmu. Nie mają już też do dyspozycji niektórych mutacji, na które do tej pory się powoływali, ponieważ wyniki omawianego tutaj badania jasno pokazują, że wiele mutacji, które uważali oni za autentycznie losowe, następuje w istocie w wyniku zaprogramowanego procesu kontroli.
Te ustalenia są więc w większej mierze zgodne z teorią inteligentnego projektu. Teoria ta przewiduje, że to, co wygląda na skutek ewolucji, jest w istocie rezultatem zaprojektowanych mechanizmów, które zostały wbudowane do organizmów. W tym przypadku są to mechanizmy zaprzęgające procesy stochastyczne do osiągnięcia funkcjonalnego celu, nie zaś zależny od przypadku proces ewolucji darwinowskiej.
Emily Reeves
Oryginał: Antibiotic Resistance: An Example of Chance and Necessity, or Programming?, „Evolution News & Science Today” 2024, May 9 [dostęp: 18 IV 2025].
Przekład z języka angielskiego: Dariusz Sagan
Przypisy
- Por. M.N. Ragheb et al., Inhibiting the Evolution of Antibiotic Resistance, „Molecular Cell” 2019, Vol. 73, No. 1, s. 157–165.e5, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.10.015.
- Por. rpoB DNA-Directed RNA Polymerase Subunit Beta [Bacillus Stercoris], „National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information” [dostęp: 24 XI 2024].
- Por. F. Kunst et al., The Complete Genome Sequence of the Gram-Positive Bacterium Bacillus Subtilis, „Nature” 1997, Vol. 390, No. 6657, s. 249–256, https://doi.org/10.1038/36786.
- M.N. Ragheb et al., Inhibiting the Evolution of Antibiotic Resistance, s. 160–161 (przyp. tłum.).
Literatura:
1. Kunst F. et al., The Complete Genome Sequence of the Gram-Positive Bacterium Bacillus Subtilis, „Nature” 1997, Vol. 390, No. 6657, s. 249–256, https://doi.org/10.1038/36786.
2. Ragheb M.N. et al., Inhibiting the Evolution of Antibiotic Resistance, „Molecular Cell” 2019, Vol. 73, No. 1, s. 157–165.e5, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.10.015.
3. rpoB DNA-Directed RNA Polymerase Subunit Beta [Bacillus Stercoris], „National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information” [dostęp: 24 XI 2024].