Wszystkie komórki pochodzą z komórki – o podstawach złożoności systemów biologicznych, cz. 3Czas czytania: 13 min

Replikacja DNA – powielenie materiału genetycznego

W 1957 roku sformułowano tak zwany centralny dogmat biologii molekularnej, według którego „kwasy nukleinowe są źródłem jednokierunkowego przepływu informacji ostatecznie określającej białka, gdzie DNA jest matrycą do syntezy RNA, a ten do biosyntezy białka w procesie translacji”¹. Przekazywanie informacji genetycznej warunkuje przetrwanie organizmów żywych. Do powielenia DNA dochodzi w jednej z faz cyklu komórkowego (faza S), a podwojony materiał genetyczny ulega rozdzieleniu do komórek potomnych w trakcie mitozy. Schemat przepływu informacji genetycznej przedstawiono na Rysunku 4.

W punkcje pierwszym zaznaczono replikację (proces powielenia materiału genetycznego w jądrze komórki oraz organellach półautonomicznych np. mitochondrium). Po replikacji DNA następuje transkrypcja (przepisanie informacji zawartej w DNA na jednołańcuchową nić RNA). RNA, po odpowiedniej obróbce,

jest transportowany z jądra do cytoplazmy komórki, gdzie wraz z rybosomem tworzy aparat „przepisujący” język nukleotydów na język aminokwasów w procesie translacji (4). Efektem końcowym tych następujących w określonej kolejności procesów jest polipeptyd, który, aby stać się w pełni funkcjonalnym białkiem, musi przejść dodatkową „obróbkę” potranslacyjną.

Procesem wykorzystywanym przez niektóre wirusy jest odwrotna transkrypcja (3). Retrowirusy (np. wirus HIV, wirusy wywołujące niektóre nowotwory) posiadają informację genetyczną zapisaną w postaci RNA, który w cyklu infekcyjnym ulega przepisaniu na DNA – jest to proces odwrotny do transkrypcji (przepisania RNA na DNA), stąd został on nazwany odwrotną transkrypcją, a enzym odpowiedzialny za przebieg procesu – odwrotną transkryptazą. Powstały pojedynczy DNA (ssDNA, ang. single strain DNA) jest uzupełniany o drugą nić (dsDNS, ang. double strain DNA) i wbudowuje się w genom gospodarza.

Proces replikacji (czyli powielenia materiału genetycznego – DNA) zachodzi w sposób semikonserwatywny, to znaczy, że po rozdzieleniu podwójnej helisy DNA każda z nici służy do utworzenia nowej nici komplementarnej, tworząc tym samym dwie potomne cząsteczki. W efekcie otrzymujemy dwie helisy, w których jedna z nici pochodzi ze „starego” DNA, a druga nić jest nowa (Rys. 5).

Za powielanie materiału genetycznego odpowiadają enzymy z rodziny polimeraz DNA. Należy podkreślić fakt, że w komórkach eukariotycznych występuje co najmniej 15 różnych polimeraz, należących do 5 różnych rodzin. Część z nich odpowiada za replikację chromosomów, a inne za replikację i naprawę DNA w mitochondrium. Główną rolę jednak odgrywa polimeraza δ, której zadaniem jest dodawanie do powstającej nici nowych nukleotydów, komplementarnych do nici matrycowej. Poza samym procesem replikacji, polimerazy DNA stoją na straży wierności procesu oraz biorą udział w wielu reakcjach związanych z naprawą DNA². Polimerazy DNA popełniają średnio jeden błąd na 10 miliardów par zasad dołączanych do nowej nici. Innymi słowy, enzym co 10 000 000 000 wbudowywanych nowych elementów dołącza jeden nieprawidłowy. Konsekwencją takiego błędu są mutacje, produkcja innych niż uprzednio białek. Mutacje są zazwyczaj czymś niezwykle niepożądanym, wprowadzającym chaos i niebezpieczne konsekwencje dla funkcjonowania całego systemu komórkowego, niekiedy zagrażające życiu osobnika. Nie zawsze tak jednak jest, bowiem dzięki zmianom w DNA gatunki mogą adaptować się do zmian w środowisku.

Proces powielania materiału genetycznego i przebieg procesu replikacji możemy podzielić na trzy główne etapy: początek (czyli inicjację), środek (elongację) i zakończenie (terminację).

W trakcie inicjacji replikacji dochodzi do rozpoznania specyficznej sekwencji zwanej miejscem rozpoczęcia replikacji. Mimo że u obu grup, Eucaryota i Procaryota, replikacja przebiega nieco inaczej, wspólną cechą pierwszego etapu jest przyłączenie się wyspecjalizowanych białek do miejsca inicjacji replikacji i miejscowe rozplecenie nici. W kolejnych etapach replikacji bierze udział spora ilość białek pełniących różne funkcje, ale dzięki ich współdziałaniu replikacja przebiega dynamicznie i sensownie.

Po lokalnym rozpleceniu nici DNA tworzy się struktura zwana oczkiem replikacyjnym. Z obu stron „oczka” rozplecione nici tworzą kształt liter Y, zwróconych do siebie rozwidleniem. W miarę postępu procesu „litery Y” będą się od siebie oddalały. Te litery to tak naprawdę rozplecione nici DNA. Prędkość przesuwania się widełek jest dość znaczna – u bakterii wynosi około 1000 par zasad (pz) na sekundę, u człowieka – około 100 pz/s³. Powielenie całego ludzkiego DDNA (3×10⁹ par zasad), podobnie jak i innych ssaków, trwa około ośmiu godzin. Taką cząsteczkę DNA ulegającą replikacji można obserwować pod mikroskopem elektronowym.

Należy podkreślić znaczenie białek towarzyszących polimerazie DNA, tworzących razem aparat replikacyjny:

• helikaza – jej rola polega na zrywaniu wiązań i oddzielaniu od siebie dwóch nici DNA. Enzym ten zbudowany jest z sześciu podjednostek, które, wirując wokół pojedynczej nici DNA i przesuwając się, jednocześnie rozplatają obecną przed sobą podwójną jeszcze helisę DNA;
• topoizomeraza I – podczas gdy helisa DNA jest miejscowo rozplatana przez helikazę, w innym miejscu, lokalnie, pojawiają się naprężenia skręceniowe. Jeśli są one zbyt duże, zahamowują aktywność helikazy i dalsze rozplatanie. Tutaj znaczącą rolę odgrywa enzym topoizomeraza I, który nacina nić DNA, pozwala jej się niejako odkręcić, rozluźniając naprężenia, a następnie z powrotem łączy zwolnione końce rozciętej nici DNA;
• topoizomeraza II – rozcina podwójną nić DNA, zapobiegając tym samym poplątaniu się nici. Dodatkowo enzym ten ma zdolność ponownego łączenia uprzednio uwolnionych końców DNA, nie pozostawiając po sobie śladu;
• białka wiążące jednoniciowy DNA – aby rozdzielone nici nie uległy ponownemu spleceniu po przesunięciu się widełek replikacyjnych, wiążą się do nich białka wiążące jednoniciowy DNA;
• ruchoma obręcz – białko, które wspomaga polimerazę DNA w utrzymaniu się na rozplecionej nici DNA, dodatkowo umożliwia polimerazie ślizgowy ruch wzdłuż łańcucha DNA;
• prymaza – polimeraza DNA nie ma możliwości samodzielnie rozpoczynać wstawiania komplementarnych nukleotydów. Stąd enzym prymaza na samym początku syntetyzuje krótki fragment RNA (starter), którego wydłużanie (już w formie DNA) kontynuuje polimeraza. Gdy starter już spełni swoją funkcję, usuwany jest przez enzym zwany RNazą;
• ligaza – łączy wolne fragmenty nowo zsyntetyzowanej nici DNA.

Jak wspomniano wcześniej, nici w DNA ułożone są antyrównolegle, to znaczy, że każda z nich ma taką samą kolejność nukleotydów, ale na przeciwnych końcach helisy DNA. Polimeraza DNA ma zdolność dodawania nowych nukleotydów tylko do jednego rodzaju końca łańcucha już istniejącego. Taki łańcuch powstający w sposób ciągły na matrycy DNA nazywamy nicią wiodącą. Co w takim razie dzieje się na drugiej nici? Właściwy koniec matrycy znajduje się do tyłu w stosunku do kierunku ruchu widełek. W takiej sytuacji przesuwająca się wraz z aparatem replikacyjnym polimeraza DNA musi wciąż odłączać się i na nowo rozpoczynać syntezę nowej nici. Aby to rozwiązanie miało sens, na matrycy, w pewnej odległości od siebie, syntetyzowane są startery (primery), czyli krótkie fragmenty RNA. Do nich polimeraza DNA dobudowuje nowe nukleotydy. Na tym etapie mamy więc fragmenty nowej nici DNA (nazwane na cześć ich odkrywcy fragmentami Okazaki) poprzedzielane starterami. Startery, jak już wiadomo, usuwane są przed odpowiednią RNazę, wstawiane są komplementarne nukleotydy, a enzym ligaza odpowiada za ich właściwe połączenie w jedną nić.

U bakterii do terminacji (czyli zakończenia procesu replikacji) dochodzi w momencie natrafienia na specjalną sekwencję dającą sygnał o zakończeniu procesu. U bardziej złożonych organizmów replikacja kończy się w momencie zetknięcia się dwóch przesuwających się widełek replikacyjnych. Ponieważ organizmy eukariotyczne posiadają liniowy DNA (u baterii jest on kolisty), pojawia się u nich problem skopiowania zakończeń nici opóźnionej, gdyż starter RNA dla ostatniego fragmentu Okazaki musiałby znajdować się poza matrycą. Stąd też na końcach chromosomów znajdują się zakończenia zwane telomerami, czyli kompleksy nukleoproteinowe, które pełnią wiele różnych funkcji, ale przede wszystkich chronią DNA przed degradacją i innymi procesami wpływającymi negatywnie na stabilność genomu. Sekwencje telomerowe to wielokrotne powtórzenia niekodującego motywu nukleotydów (u człowieka sekwencja TTAGGG jest powtórzona około 2500 razy). Dzięki takiemu zabezpieczeniu, przy każdym podziale komórki, skracaniu ulegają te niekodujące powtórzenia, a kodujący materiał genetyczny pozostaje nienaruszony. Skracanie się telomerów bywa nazywane „zegarem biologicznym”, gdyż ich utrata związana jest z zahamowaniem kolejnych podziałów komórki, które w ludzkim rozumieniu może być po prostu procesem starzenia się. W obliczu współczesnej wiedzy jest to bardziej hipoteza niż fakt naukowy, ale badania w tym kierunku trwają. Oczywiście istnieje metoda zapobiegawcza, bowiem w niektórych komórkach znajduje się enzym zwany telomerazą, posiadający zdolność dobudowywania skracanych fragmentów telomerów, na zasadzie odwrotnej transkrypcji⁴.

Transkrypcja – od DNA do RNA

Korelację między DNA a produkcją właściwego białka bardzo obrazowo przedstawiono w Podstawach biologii komórki Albertsa:

DNA nie kieruje syntezą białka osobiście, działa raczej jako menedżer dający polecenia zespołom swoich „współpracowników”.

Pierwszym etapem na drodze do wytworzenia potrzebnego komórce białka jest przepisanie określonej sekwencji DNA na RNA w procesie zwanym transkrypcją. Dzięki temu możliwe jest wytworzenie z pojedynczego genu większej ilości konkretnego białka, niż gdyby DNA było bezpośrednią matrycą do jego syntezy. Po odpowiednich modyfikacjach (opisanych w dalszej części artykułu) to RNA stanowi wzorzec w procesie wytwarzania białka, czyli translacji.

DNA i RNA to kwasy, które używają podobnych „liter” z alfabetu nukleotydów. Różnice chemiczne, choć są minimalne, mają bardzo istotne znaczenie dla całego procesu. RNA budują nukleotydy (cukier + zasada + reszta fosforanowa), w których cukrem jest ryboza, a nie tak jak w DNA – deoksyryboza, czyli ryboza pozbawiona jednej z grup OH. Podobnie jak w DNA, na RNA składają się zasady azotowe: guanina, cytozyna, adenina, ale zamiast tyminy (tak jak w DNA) występuje uracyl. Kolejność nukleotydów w RNA jest podyktowana wyłącznie kolejnością nukleotydów w transkrybowanym fragmencie DNA. Powstające RNA jest znacznie krótsze niż nić DNA, a to dlatego, że RNA stanowi wyłącznie kopię określonego rejonu DNA. Za wstawianie i łączenie nukleotydów odpowiadają enzymy zwane polimerazami RNA – katalizują one tworzenie się wiązań fosfodiestrowych pomiędzy kolejnymi wstawianymi „literami”. Ponadto RNA występuje zazwyczaj w formie jednoniciowej i może przyjmować rozmaite kształty, co ma znaczenie dla roli, jaką dane RNA odgrywa. Powstający łańcuch RNA nosi nazwę transkryptu.

Podobnie jak w procesie replikacji, w transkrypcji wyróżniamy trzy etapy (Rys. 6). Są to:

1. Inicjacja – żeby polimeraza RNA mogła rozpocząć transkrypcję danego genu, musi znaleźć jego początek. W

   

   odróżnieniu od polimerazy DNA biorącej udział w replikacji, polimeraza RNA nie wymaga żadnego startera i może rozpocząć syntezę łańcucha od dołączenia pojedynczego nukleotydu. U bakterii sprawa jest prosta: na początku polimeraza swobodnie wiąże się z DNA, a następnie wślizguje się na matrycę i przesuwa wzdłuż helisy aż do momentu, gdy rozpozna specyficzny fragment położony blisko naszego genu i jednocześnie dający polimerazie sygnał do rozpoczęciu transkrypcji. Jest to tak zwane miejsce promotorowe lub po prostu promotor. Właściwie ułożona i związana z DNA polimeraza RNA rozplata miejscowo, jednocześnie ją rozdzielając, eksponując tym samym niesparowane zasady. Trzeba też podkreślić rolę sekwencji wzmacniających transkrypcję, które mogą być położone w dużych odległościach od startu transkrypcji.
2. Elongacja – po związaniu się polimerazy z promotorem i rozpleceniu helisy enzym ten może już przesuwać się wzdłuż nici matrycowej i dołączać komplementarne do tej nici nukleotydy, wydłużając tym samym powstający łańcuch RNA. Obszar, w którym znajduje się polimeraza RNA, rozpleciona helisa DNA oraz wydłużany łańcuch RNA, nazywa się często bąblem transkrypcyjnym. Drugą z nici (po której polimeraza się nie przesuwa) nazywa się nicią kodującą, gdyż jej sekwencja jest prawie identyczna z sekwencją nowego łańcucha – jedyną różnicę stanowi uracyl zamiast tyminy w RNA. Wiele lat trwano w przekonaniu, że polimeraza RNA nie posiada zdolności naprawiania swoich błędów. Dopiero ostatnimi czasy doświadczalnie dowiedziono, że polimeraza niejako cofa się i poprawia błędnie wstawiony nukleotyd. Szacuje się, że enzym ten popełnia błąd średnio raz na 10⁴–10⁵ nukleotydów, czyli znacznie częściej niż w przypadku polimerazy prowadzącej proces replikacji. Taka omyłkowość jest dopuszczalna, gdyż błędne transkrypty nie są przekazywane kolejnym pokoleniom, a ich obecność nie szkodzi osobnikowi.
3. Terminacja – łańcuch RNA wydłuża się aż do momentu przepisania przez polimerazę sekwencji dającej sygnał STOP⁵. Łańcuch RNA odłącza się od matrycy DNA. Alternatywą dla takiego zakończenia jest udział białka Rho, które najpierw przyłącza się do łańcucha RNA w miejscu wystąpienia sekwencji rozpoznawanej przez to białko, a następnie przesuwa się wzdłuż łańcucha, „goniąc” niejako polimerazę. W momencie złapania enzymu, białko Rho zmienia jego konformację (ułożenie w przestrzeni), przyczyniając się do odłączenia polimerazy RNA od transkryptu.

Przebieg procesu transkrypcji między prokariotą a eukariotą jest podobny, ale nie identyczny. O kilku różnicach wspomniano już wcześniej. Ważnym zjawiskiem, obserwowanym u wyższych organizmów, jest ścisła kontrola precyzji mechanizmów ekspresji genów. Elementy wpływające na przebieg transkrypcji mogą być położone w bardzo dużej odległości w DNA od transkrybowanego genu. To od nich zależy, z jaką intensywnością będzie przebiegał proces. Ponadto w komórkach eukariotycznych mamy do czynienia z rozdzieleniem czasowym i przestrzennym procesu transkrypcji, a później translacji, bowiem przepisanie informacji genetycznej z DNA na RNA oraz dojrzewanie transkryptu (także mRNA) zachodzi w jądrze komórkowym, dopiero później zostaje on przetransportowany do cytoplazmy, gdzie następuje jego translacja.

Kolejnym mechanizmem kontrolującym ekspresję genów są liczne polimerazy przeprowadzające transkrypcję. U wyższych organizmów główne są trzy polimerazy stojące na straży poprawności procesu transkrypcji oraz jedna polimeraza odpowiedzialna za ekspresję genów w mitochondrium. Każda polimeraza specjalizuje się w transkrybowaniu innej części genomu i różni się usytuowaniem w jądrze komórkowym oraz poziomem wrażliwości na inhibitory – związki mające zdolność hamowania aktywności enzymów.

Gabriela Janusz

— Koniec części trzeciej —

Ostatnia aktualizacja strony: 14.07.2021

Źródło zdjęcia: Shutterstock