Wiemy już, że to DNA jest tą instrukcją, która dostarcza informacji o tym, jakie białka mogą powstać.
Zazwyczaj hasło „białko” kojarzy nam się z jakąś ogólną masą, którą powinniśmy uwzględnić przy sporządzaniu każdego posiłku. Rzeczywiście, jest to bardzo ważna grupa związków budująca nasze ciało, ale też pełniąca wiele innych, równie istotnych funkcji. Białka biorą udział w zasadzie w każdym procesie zachodzącym w komórkach zarówno zwierzęcych, jak i roślinnych. Zbudowane są głównie z atomów węgla, azotu, tlenu i wodoru, choć istnieją i takie, w których znaleźć można siarkę, fosfor, żelazo czy mangan.
Białka różnią się między sobą nie tylko budową, ale również pełnioną funkcją, i tak na przykład hemoglobina odpowiada za transportowanie tlenu do wszystkich komórek ciała, rodopsyna w oku odbiera bodźce świetlne, a przeciwciała klasy IgE uczestniczą w zwalczaniu pasożytów i w reakcjach alergicznych. Rola jeszcze innych białek będzie związana z trawieniem pokarmu czy wytwarzaniem ruchu w mięśniach – niesamowite współdziałanie miozyny i aktyny oraz innych białek w regulacji skurczu mięśni jest tutaj idealnym przykładem wieloelementowego „aparatu”, w którym wszystkie składowe są niezbędne, aby cały projekt mógł sprawnie funkcjonować.
Różnorodność funkcji jest oczywiście wynikiem gigantycznej ilości struktur przestrzennych wynikających z rodzaju i kolejności aminokwasów – podstawowych „cegiełek”, z których zbudowane jest każde białko w organizmie. Aminokwasy w białku połączone są ze sobą w długi łańcuch. Kolejność aminokwasów w białku jest odzwierciedleniem zapisu informacji genetycznej, a dokładniej – kolejności nukleotydów w DNA. Mimo że aminokwasów białkowych jest tylko 20, to możliwości kombinacji ich ułożenia w łańcuchu jest niewyobrażalnie dużo. Aminokwasy z danego łańcucha białkowego mogą ze sobą oddziaływać, stąd też każde białko globularne wykazuje tendencję do zwijania się i przyjmowania najodpowiedniejszej energetycznie struktury przestrzennej, określanej mianem natywnej. Taka natywna konformacja białka jest utrzymywana w odpowiednich warunkach pH i temperatury, każda zmiana tych parametrów wpływa na zmianę struktury 3D białka. Należy podkreślić, że to właśnie prawidłowe ułożenie białka w przestrzeni determinuje jego rolę w organizmie.
W białkach możemy wyróżnić kilka hierarchicznie ułożonych poziomów organizacji struktury:
Struktura I-rzędowa to ilość i kolejność ułożenia aminokwasów w łańcuchu białka, połączonych wiązaniemRys. 2. Rzędowa struktura białek. Źródło zdjęcia: https://tiny.pl/9hndx [dostęp 24.06.2021].peptydowym. Strukturę I-rzędową można porównać do tekstu napisanego przy użyciu 20-elementowego alfabetu. Każdy aminokwas jest taką pojedynczą literą, a kolejność ułożenia tych liter warunkuje sens całości. Zmiana bodaj jednej litery tekstu (mutacja aminokwasu w białku) jest niewyobrażalnym błędem, pociągającym za sobą niebezpieczne dla organizmu konsekwencje. Przykładem jest zmiana jednego aminokwasu w łańcuchach hemoglobiny, co prowadzi do słabszego niż normalnie wiązania tlenu przez hemoglobinę oraz do zmiany kształtu samych czerwonych krwinek – są one bardziej łamliwe i krócej żyją.
Strukturę II rzędu wyznaczają oddziaływania (głównie wiązania wodorowe) między atomami wiązań peptydowych łączących aminokwasy. Najpopularniejszymi strukturami II rzędu są: α-helisa (struktura przypominająca spiralę) oraz β-kartka (β-harmonijka) – w tej strukturze łańcuch polipeptydowy przyjmuje kształt złożonej kartki w formie harmonijki czy też wachlarza.
Struktura III rzędu (jak wspomniano powyżej) to ułożenie w przestrzeni struktur II rzędu oraz fragmentów nieregularnych. Jednymi z najsilniejszych wiązań występujących między resztami aminokwasów są wiązania między atomami siarki dwóch cystein (wiązanie disiarczkowe), które można porównać do swoistych „agrafek” spinających łańcuch.
Struktura IV rzędu tworzy się w momencie, gdy oddziałuje ze sobą kilka odrębnych łańcuchów polipeptydowych. Nie każde białko wykazuje ten poziom organizacji. Przykładem białka posiadającego strukturę IV rzędu jest hemoglobina czy polimeraza DNA.
Niektóre źródła sugerują, że białka zaczynają się formować tuż po odłączeniu się od aparatu prowadzącego translację1. W mechanicznym procesie zwijania się białek uczestniczą tak zwane białka opiekuńcze lub inaczej szaperony. Ich obecność jest niezbędna dla uzyskania właściwego pofałdowania, ponadto zapobiegają one powstawaniu agregatów niewłaściwie upakowanych białek, które to stanowią podłoże wielu chorób.
Po uwolnieniu się łańcucha polipeptydowego z aparatu translacyjnego, a czasem jeszcze w trakcie translacji, przechodzi on przez szereg modyfikacji, które wzbogacają aminokwasy o nowe cechy wpływające nie tylko na budowę białka, ale również na jego aktywność, funkcję i właściwości.
Modyfikacje te dokonują się poprzez przyłączanie różnych grup funkcyjnych do reszt aminokwasowych lub też inne zmiany struktury. Mogą być to zmiany nieodwracalne, które warunkują funkcję białka (np. przyłączenie hemu do białkowego łańcucha cytochromu), lub odwracalne, które regulują jego aktywność (np. przyłączanie grupy acetylowej). Do modyfikacji nieodwracalnych zaliczamy również taką zmianę, która kieruje białko na drogę degradacji.
Do modyfikacji wzbogacających łańcuch w nowe funkcje zalicza się między innymi glikozylację i fosforylację. W obu przypadkach chodzi o przyłączenie dodatkowych fragmentów – w glikozylacji kawałka cukrowego, a w fosforylacji – reszty fosforanowej. Białka wzbogacone o te składniki odgrywają w organizmie ważne role, te z fragmentami cukrowymi funkcjonują na przykład jako hormony, białka surowicy, przeciwciała czy też składniki płynu w torebkach stawowych, a te z resztami fosforanowymi to między innymi białka występujące w mleku. Ponadto białka fosforylowane odgrywają zasadniczą rolę w regulacji aktywności komórkowej, bowiem przyłączanie i odłączanie reszty fosforanowej jest swego rodzaju sposobem odpowiedzi komórki na zmiany środowiskowe.
Takich „hybryd” białkowych jest znacznie więcej, dzięki czemu białka wykazują ogromną różnorodność funkcji, a wskutek możliwości remodelowania już gotowej hybrydy komórka może dostosowywać swoją wewnętrzną maszynerię do aktualnych potrzeb organizmu.
Enzymy
Z czysto chemicznego punktu widzenia enzymy to biokatalizatory, których zadaniem jest przyspieszanie przebiegu reakcji chemicznych zachodzących w organizmach żywych, nie ulegając przy tym zużyciu. Bardzo trafnie definicję tę wytłumaczono w jednym z artykułów „Wszechświata”:
Wyobraźmy sobie reakcję chemiczną […] jako zatłoczone rondo w środku dużego miasta. Samochody wjeżdżające drogą na rondo to substancje chemiczne, które będą ulegały przekształceniu (tzw. substraty), zaś każda z dróg opuszczająca rondo to inna ścieżka reakcji. Z kolei samochody opuszczające rondo to produkty, różniące się pod względem budowy cząsteczki chemiczne. Ponieważ rondo jest zakorkowane, wszystkie reakcje postępują dość wolno i każdy samochód wjeżdżający na nie straci sporo czasu, zanim je opuści (tj. przemieni się w produkt reakcji). Katalizator możemy wyobrazić sobie jako wielką estakadę przerzuconą nad zatłoczonym rondem, która wiedzie w kierunku najbardziej potrzebnym dla naszej komórki czy środowiska. Teraz samochody bardzo szybko przemykają nad korkiem (przyspieszenie reakcji) i większość z nich wybierze właśnie tę drogę (skierowanie ruchu na wybraną ścieżkę). […] Efekt estakady nad korkiem jest nazywany przez chemików „obniżeniem energii aktywacji”2.
W każdej reakcji chemicznej biorą udział substraty, czyli to, co ze sobą reaguje, i produkty, czyli to, co powstaje w wyniku reakcji substratów. Aby reakcja mogła mieć miejsce, substraty muszą się do siebie zbliżyć, odpowiednie wiązania muszą ulec rozerwaniu, a same substraty zmieniają kształt na energetycznie niekorzystny. Ten tak zwany stan przejściowy podnosi stan energetyczny całego układu. Taki wzrost energii nazywa się fachowo energią aktywacji. Jeśli poziom tej energii jest bardzo wysoki, niewielka ilość cząsteczek będzie mogła ulec reakcji, a w konsekwencji powstanie niewielka ilość produktu – reakcja przebiega bardzo powoli. Wpływ enzymów na stan przejściowy układu jest nieoceniony, bowiem enzymy wiążą substraty (jeden lub oba naraz) i przytrzymują je w taki sposób, że obniżają energię aktywacji, dzięki czemu reakcje mogą zachodzić szybciej i efektywniej.
Enzymy wykazują tak zwaną specyficzność, co oznacza, że dany typ enzymu katalizuje ściśle określoną reakcję lub tez wiąże konkretny rodzaj substratu, jak na przykład polimeraza DNA, która nie tylko katalizuje reakcję dołączania komplementarnych nukleotydów, ale również sprawdza poprawność, poprawiając swoje ewentualne błędy. Specyficzność może także dotyczyć grupy reakcji czy też konkretnego typu wiązania, ale najczęściej jest to specyficzność substratowa, za którą odpowiada tak zwane centrum aktywne enzymu. W budowie biokatalizatorów białkowych obserwuje się specjalną „kieszonkę”, do której wślizguje się substrat. Na to centrum aktywne składają się łańcuchy boczne aminokwasów, które, jak pamiętamy, w zależności od długości i składu wykazują różne właściwości. Dopasowanie przestrzenne centrum aktywnego do substratu (lub substratów) zwiększa się już po ich związaniu, co nazwano „indukowanym dopasowaniem”, choć wcześniej sądzono, że enzym i substrat są do siebie dopasowane jak klucz do zamka.
W jaki sposób enzym odnajduje substrat w komórce? Pytanie w zasadzie należałoby odwrócić, gdyż to substrat (w zależności od jego stężenia) „odszukuje” enzym, na zasadzie dyfuzji. Im substratu jest więcej, tym istnieje większa szansa, że w całej masie przypadkowo zderzających się cząsteczek ten konkretny substrat natrafi na odpowiadający mu enzym. Oczywiście to wszystko nie jest takie proste, bowiem w komórce – jak w budynku, w którym znajduje się wiele mieszkań – obecne są wydzielone rejony i wspomniane wcześniej organelle. Rozdzielenie tych struktur jest tutaj celowe i jak najbardziej słuszne. Pewne procesy zachodzące w mitochondrium czy w jądrze zachodzą tylko na obszarze tej struktury, a co za tym idzie, pewne substancje wymagane do tych procesów znajdują się tylko na tym obszarze lub też są do niego transportowane w sposób inny niż na zasadzie prostej dyfuzji. To tak jakbyśmy weszli do wspomnianego budynku, wiedząc, że mamy trafić pod konkretny numer mieszkania, bo na przykład mamy pewną przesyłkę do dostarczenia właśnie pod ten adres. Niestety, nie wiemy, na którym piętrze znajduje się mieszkanie, ale ostatecznie trafiamy pod drzwi. Aby dostarczyć przesyłkę, musimy zapukać albo też zadzwonić dzwonkiem. Podobnie się to odbywa w komórce, choć niekiedy bywa, że ową „przesyłkę” musi odebrać na przykład portier. W komórce takim portierem są różnego typu kanały przystosowane do odbierania jednego typu cząsteczek.
Szybkość reakcji zależy więc od stężenia substratu. Jeśli stężenie substratu rośnie, to jednocześnie zwiększa się szybkość tworzenia odwracalnego kompleksu enzym-substrat [ES]. Szybkość tego procesu rośniej jednak tylko do pewnego momentu, który nazywamy szybkością maksymalną. Po osiągnięciu tej wartości, prędkość już się nie zmienia, mimo wzrastającego stężenia substratu. Oznacza to, że wszystkie centra aktywne dostępnych enzymów zostały już „zajęte” przez substraty. Jest to model charakterystyki kinetyki reakcji ‒ zaproponowali go Leonor Michaelis oraz Maud Menten w 1913 roku i obowiązuje on po dziś dzień.
Jak wspomniano wcześniej, enzymy są białkami (choć nie wszystkie), zatem zbudowane są z aminokwasów. Wiemy już, że sekwencja i ilość aminokwasów w białku zależą od sekwencji zakodowanej w DNA. Dzięki oddziaływaniom pomiędzy resztami aminokwasowymi, łańcuch polipeptydowy zwija się w coś na kształt kłębka. Jedne enzymy będą miały mniej, inne bardziej skomplikowaną budowę, jednak zazwyczaj bezbłędnie ulegają konformacyjnym przekształceniom prowadzącym do uzyskania pełnej funkcji. Proces tak zwanego fałdowania wciąż nie został w pełni rozpracowany, o czym traktuje cytowany artykuł:
Pomimo wielu badań w tej dziedzinie oraz ogromnego postępu metod symulacji komputerowych zwijania się (tzw. fałdowania) białek wciąż nie jesteśmy w stanie przewidzieć z wystarczającą dokładnością przestrzennej struktury białek, bazując wyłącznie na sekwencji aminokwasowej3.
Na aktywność enzymów wpływają czynniki środowiskowe, takie jak temperatura czy pH. Zazwyczaj enzymy wykazują najwyższą aktywność w pewnym zakresie tych parametrów, przy czym znaczny wzrost temperatury (powyżej 40°C) czy też skrajnie zasadowe lub kwasowe środowiska prowadzą do ich denaturacji i zniszczenia struktury.
Działalność enzymów, których w komórce jest niezliczona ilość, podlega ścisłej kontroli. Jest to niezbędny element prawidłowego funkcjonowania złożonych i zawiłych dróg metabolicznych, które niczym w labiryncie ulegają rozgałęzieniom, a enzymy napotykane na różnych ścieżkach często wykorzystują ten sam substrat. Sposobów regulacji jest kilka, jednak najszybszą i najprostszą metodą jest kontrola i dostosowanie szybkości samej reakcji do aktualnych zapotrzebowań komórki. Może się to odbywać przez tak zwane sprzężenie zwrotne, czyli wiązanie się do enzymu samego produktu końcowego szeregu reakcji w miejscu wiązania substratu używanego na początku tego szlaku przemian. Takie zabezpieczenie chroni przed nadmierną produkcją substancji. Może też się zdarzyć tak, że dany produkt końcowy szlaku reakcji będzie stymulował enzym początkowy, zwiększając jego aktywność. Hamowanie (tzw. inhibicja) zwrotne zwykle ma miejsce na początku szlaku, ale może też niekiedy obejmować wewnętrzne przemiany. Dotyczy to przede wszystkim szlaków rozgałęziających się.
No dobrze, ale wspomniano wcześniej, że centrum aktywne jest ściśle dopasowane do kształtu substratu. Jak zatem może dojść do związania cząsteczki regulatorowej? Już w latach sześćdziesiątych ubiegłego wieku naukowcy dowiedli, że, oprócz centrum aktywnego, enzym posiada inne miejsce wiązania, tak zwane centrum allosteryczne. Związanie w tym miejscu cząstek hamujących lub aktywujących enzym wpływa na kształt centrum aktywnego. Tak więc nadmiar produktu, łącząc się z centrum allosterycznym pierwszego enzymu, wpływa hamująco na pierwszy enzym szlaku metabolicznego, hamując tym samym zachodzenie kolejnych reakcji łańcucha.
Rys. 7. Zarys przebiegu reakcji (a) i hamowania przez inhibitor kompetycyjny (b). Źródło zdjęcia: https://tiny.pl/9hn5n [dostęp: 24.06.2021].
Innym sposobem hamowania aktywności enzymów jest tak zwana inhibicja kompetycyjna (Rys. 3) i niekompetycyjna. Oba typy hamowania są odwracalne, co oznacza, że związane czynniki hamujące (inhibitory) po odegraniu swojej roli odłączają się od enzymu, przywracając tym samym jego aktywność.
W inhibicji kompetycyjnej inhibitor konkuruje z substratem o centrum aktywne. Tak więc w danym momencie enzym może związać w centrum aktywnym zarówno substrat, jak i inhibitor na zasadzie „kto pierwszy ten lepszy”. Jeśli enzym zwiąże substrat – enzym pozostanie aktywny, a jeśli związaniu ulegnie cząstka hamująca – enzym zostanie unieczynniony. Jeśli w środowisku będzie więcej inhibitora niż substratu, większość cząsteczek enzymu zostanie zdezaktywowana, a prędkość reakcji znacznie spadnie. Prędkość maksymalna może zostać osiągnięta jedynie w przypadku wysokiego stężenia substratu.
W drugim typie hamowania, czyli inhibicji niekompetycyjnej, inhibitor wiąże się z enzymem w miejscu innym niż centrum aktywne. W tej sytuacji substrat może swobodnie i bezstresowo wejść w centrum aktywne, jednak enzym pozostanie nieczynny ze względu na jednoczesną obecność czynnika hamującego.
Na aktywność wielu enzymów wpływa także obecność innych czynników, tak zwanych kofaktorów, bez których zdarza się, że enzym nie działa poprawnie lub nie działa w ogóle. Kofaktory to niebiałkowy element, który łącząc się z częścią białkową enzymu (apoenzymu), tworzy funkcjonalny holoenzym. Kofaktory mogą być silnie z enzymem związane (grupa prostetyczna) wiązaniami kowalencyjnymi lub być do niego luźno przyłączone (koenzymy) poprzez wiązania jonowe lub wodorowe. Grupami prostetycznymi będą zazwyczaj jony metali, na przykład polimeraza DNA do swej aktywności wymaga jonów Mg2+. Koenzymami mogą być związki organiczne, i zazwyczaj są to witaminy, lub też witaminy mogą być prekursorami koenzymów.
Enzymy wstępnie opisywano już w latach osiemdziesiątych XVIII wieku. Następne lata i wyniki kolejnych doświadczeń wpłynęły na wzrost zainteresowania tą częścią mikroświata. Obecnie wiadomo, że enzymy biorą udział w niemalże każdej reakcji zachodzącej w organizmach żywych, warunkując ich funkcjonowanie. Ważnym odkryciem w zakresie biokatalizy okazały się niebiałkowe cząsteczki wykazujące aktywność katalityczną, nazwane rybozymami i deoksyrybozymami, ze względu na to, że są to kwasy nukleinowe. Tak o rybozymach pisano w „Wiadomościach Chemicznych”:
W trakcie badań nad procesem splicingu [Thomas] Cech zauważył, że wycinanie intronów RNA u jednokomórkowego organizmu eukariotycznego Tetrahymena thermophila nie wymaga udziału białek. Zatem cząsteczki RNA w specyficznych sytuacjach mogą wykazywać właściwości enzymatyczne. Podobne wnioski sformułował [Sidney] Altman na podstawie obserwacji, że do dojrzewania cząsteczek tRNA przy udziale komponentu RNA RNazy P wymagana jest tylko obecność jonów magnezu. W późniejszych latach odkryto szereg występujących w naturze rybozymów, między innymi hammerhead i hairpin, pochodzące z wirusów roślinnych, VS występujący w transkrypcie mitochondrialnego DNA pleśni Neuspora crassa oraz rybozym HDV, znaleziony w wirusie zapalenia wątroby typu D. Wszystkie naturalnie występujące rybozymy posiadają zdolność przecinania łańcucha RNA, a w przypadku rybozymu hairpin – także ligacji fragmentów RNA4.
Szczegółowa i wnikliwa analiza badań nad enzymami dostarcza wiedzy niezbędnej dla rozwoju medycyny, w tym diagnostyki lekarskiej, preparatyki leków, ale także innych gałęzi życia, między innymi przemysłu spożywczego. Badania naukowe z ostatnich lat dostarczają coraz to ciekawszych wieści jak na przykład doniesienia o znacznej efektywności enzymów w katalizie nietypowych dla siebie reakcji, przecząc tym samym twierdzeniu o „specyficzności”5. Szerokie bazy danych gromadzące informacje o dotychczas zbadanych i wciąż analizowanych cząsteczkach i zdolnościach katalitycznych oraz o ich modyfikacjach, są nieocenionym źródłem informacji o możliwościach wykorzystania tych cech w praktyce.
Por. R.D. Wegrzyn, E. Deuerling, Molecular Guardians for Newborn Proteins: Ribosome-Associated Chaperones and Their Role in Protein Folding, „Cellular and Molecular Life Sciences” 2005, Vol. 62, No. 23, s. 2727–2738.
M. Szaleniec, Enzymy – katalizatory życia, „Wszechświat” 2017, t. 118, nr 4–6, s. 108–117.
Szaleniec, Enzymy – katalizatory życia, s. 108‒117.
J. Wrzesiński, J. Ciesiołka, Regulacja aktywności katalitycznej rybozymów HDV oraz deoksyrybozymów za pomocą antybiotyków i jonów metali, „Wiadomości Chemiczne” 2018, t. 72, nr 7–8, s. 397–415.
Por. H. Kalinowska i in., Biokataliza, „Kosmos” 2007, t. 56, nr 3–4, s. 327–334.
